博鱼网站 BOYU博鱼网站 BOYU免费在线种常见植物的提取 由隐地病变的非洲菊病是土壤传播疾病，是非洲菊病的严重危害之一。我国内地栽培多年的非洲菊品种,无论是从荷兰还是从我国台湾引入的品种,一般情况下发病率为20%~30%,严重时可达80%以上。长期以来,非洲菊疫病的防治以化学防治为主,甲霜灵锰锌和杀毒矾等药剂对该病具有良好的防治效果,但是由于长期大量使用,使得不少种植基地产生了抗性菌株从而大大降低其防治效果。 植物是生物活性化合物的天然宝库,其产生的次生代谢产物超过40万种,其中许多次生化学物质具有杀虫或抑菌等生物活性,在农业、医药上有重要的研究价值,有的植物提取物甚至可以直接用于一些农作物病害的防治。Grainge等曾报道地球上的25万多种植物中,约有2 400种植物具有控制有害生物的活性成分。在《中国土农药志》记载的220种植物中,约有1/2植物的水提取物或醇提取物对农作物病害表现出抑制作用。云南素有“植物王国”之称,在开发植物源农药方面有着得天独厚的资源优势,其原材料取自天然植物,具有无公害、无残留、不易产生抗药性、成本低廉等优点,是公认的绿色农业,可广泛用于农作物有害生物防治。本文选用云南田间常见的6种植物,用其提取物对非洲菊疫病病菌(Phytophthora cryptogea)的抑菌活性进行了筛选。 1 材料和方法 1.1 其他常见植物和杂草 桉树(Eucalyptus globulus Labill.)、白蒿(Artemisia sieversiana Ehrh.ex Willd.)、青蒿(Artemisia apiacea Hance)、紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum Spreng)、蛇床子(Fructus cnidii Fruit)和芹菜(Apium graveolens L.)为云南常见植物和杂草。非洲菊疫病病原菌为本实验室分离和保存,采用强致病菌株KYa P-5,非洲菊健康种苗为高感疫病品种白马王子。 1.2 方法 1.2.1 植物提取物的制备 采集新鲜的植物叶片,清洗干净,75%酒精消毒片刻,灭菌水漂洗3次,剪碎后加入3倍体积的蒸馏水浸提24 h,倒出浸提液,用榨汁机将浸提过的植物叶片打碎,纱布过滤,将滤液与浸提液混和,12 000 r/min离心5 min,取上清液,旋转蒸发仪进行浓缩(浓缩6倍体积),浓缩液于4℃冰箱中保存备用(以下称浓缩液为植物提取物)。 1.2.2 隐地疫霉菌子胞菌的培养 将保存的隐地疫霉菌株KYa P-5恢复菌株活性,纯化培养于番茄胡萝卜培养基(胡萝卜150 g、番茄150 g、琼脂粉15 g、碳酸钙0.4 g、蒸馏水1 000 m L,p H值7.0)中备用。将纯化好的隐地疫霉菌株KYa P-5从菌落边缘切取2 mm×2 mm的菌丝块,移至番茄胡萝卜培养液中,在25℃黑暗条件下培养4 d后,倒去培养液,换上灭菌土壤浸出液,在25℃光照条件下培养2~3 d后在显微镜下镜检是否产生孢子囊。待产生大量孢子囊后,将孢子囊悬浮液置于4℃冰箱中15 min,再放入25℃恒温箱中约20 min使游动孢子充分释放,于磁力振荡器上混匀,并将孢子浓度调至约1.0×109个/L。 1.2.3 非洲菊高效液相保湿保鲜试验 1)抑菌活性测定 取2 m L植物提取物与20 m L番茄胡萝卜培养基混装于200 m L三角瓶中(以蒸馏水为对照),灭菌,倒入灭菌培养皿中,待培养基凝固后,用直径为0.5 mm的打孔器从平皿中取培养10 d左右的隐地疫霉KYa P-5,置于平板培养基中央,每处理6次重复,在28℃培养箱内培养,每隔24 h测定1次菌落直径,直至对照长满培养皿,计算各提取物对菌丝生长的抑制效果。 2)离体抗菌活性测定 从健康非洲菊植株上采集大小一致的叶片,清洗干净后用酒精消毒片刻,用灭菌水漂洗3次,晾干。取植物提取物均匀涂于叶片表面,晾干,然后用大头非洲菊叶片,每个叶片刺3个接种点,取隐地疫霉孢子囊悬浮液10μL滴于接种点上,以灭菌水为对照。每处理6次重复。将接种后的叶片置于灭菌培养皿中,于28℃培养箱内保湿培养,在白天光照、晚上黑暗的培养箱中培养4 d后,观察记录发病情况。 3)田间防效测定 选取菌丝生长抑制活性和离体抗菌活性效果较好的植物提取物进行防治试验。待非洲菊种苗在实验田移植成功后,先用灭菌镊子将根部造成微伤,然后将制备好的隐地疫霉孢子悬浮液灌根接种于根部,同时将植物提取物灌于根部,每株灌60 m L,每3 d进行1次植物提取物的浇灌,以蒸馏水为对照。保湿48 h后,按常规管理。3 d后开始调查植物发病情况。15 d后停止浇灌植物提取物,继续调查发病情况,发病情况调查至第28天。非洲菊疫病病情分级标准为0级:无病;1级:1/2以下病叶萎蔫;2级:1/2以上病叶萎蔫;3级:全部叶片均萎蔫,有的叶片开始干枯;4级:全株枯死。 1.2.4 实验数据的统计分析 数据采用Excel 2003和SAS 8.0软件进行统计分析。 2 结果与分析 2.1 种植物生长情况 6种植物提取物对隐地疫霉菌丝生长有不同的抑制效果。其中白蒿的抑制效果最好,达到91.46%,显著高于其他5种植物,与对照有极显著差异;桉树与青蒿抑制率分别为70.00%、62.20%,二者抑制效果与对照也有显著差异,紫茎泽兰的抑制率为31.77%,芹菜的抑制效果较差,仅为3.43%,而蛇床子对隐地疫霉菌丝不但没有抑制效果,反而促进其生长(见表1)。 2.2 种植物提取物对白蒿、蛇床子的抑制率 白蒿、青蒿、桉树3种植物提取物对病斑有较好的抑制效果,抑制率分别为71.54%、51.64%、50.00%,其中白蒿的抑制效果最好,这3种植物提取物与对照有显著差异,紫茎泽兰、蛇床子抑制效果较差,抑制率分别为20.82%、15.37%,与对照无显著差异,芹菜抑制率为-1.00%,对病斑不但没有抑制效果,反而促进病斑的扩大(见表2)。 2.3 种植物提取物对非洲菊病的防治效果 根据6种植物提取物对菌丝生长抑制效果和离体抗菌活性测定结果,选取抑制效果较好的桉树、白蒿、青蒿3种植物提取物用于田间非洲菊疫病的防治效果测定。 第14天调查结果表明:桉树、白蒿、青蒿对由隐地疫霉引起的非洲菊疫病有不同的防治效果。其中青蒿的相对防治效果达到86.58%,桉树次之,防治效果达65.92%,白蒿防治效果较差,仅为40.78%(见图1)。 第28天发病率调查结果表明:当停止施用植物提取物后,3种植物提取物对非洲菊疫病的防治效果迅速下降,青蒿、桉树的相对防治效果分别为58.18%和43.35%,白蒿防治效果较差,为20.11%(见图1)。据病情指数统计结果可以看出,第28天对照的病情指数为97.65,白蒿、桉树、青蒿植物提取物处理的植株病情指数分别为78.01、55.32、40.38,施用过植物提取物后各处理植株的病情指数明显低于对照病情的指数(见图2)。 3 对非洲菊或白蒿和青蒿和桉树的相对防治效果 选用6种云南当地田间常见的植物进行室内对非洲菊疫病病菌的菌丝生长抑制及其离体抑菌活性试验,室内试验结果表明:白蒿、青蒿、桉树对隐地疫霉菌丝生长及离体抑菌活性有较好的抑制效果,其中白蒿抑制效果最好,达90%以上;而紫茎泽兰、蛇床子、芹菜防治效果都低于32%。因此,本研究选取抑制效果较好的白蒿、青蒿、桉树3种植物提取物应用于非洲菊疫病的田间防治试验,却发现,青蒿、桉树用到田间活体植株上其相对防治效果明显高于室内试验的防治效果,而白蒿的田间防治效果却不及室内抑菌效果。从总体上看,3种植物提取物的施用不但推迟非洲菊疫病的发生而且也减轻了病害症状。 目前,抗植物病原菌的植物资源筛选是研究的热点,而大多数研究都是采用植物病原真菌的离体筛选方法,而对活体筛选方法研究较少。2006年,张培花等报道了紫茎泽兰对马铃薯晚疫病菌有较好的抑制效果,李玉群等报道利用植物生物熏蒸产生的GSLs的水解产物可以对多数植物土传病原菌有较好的抑制效果,这些报道都是在离体的条件下筛选抗病原菌活性物质的。2008年,张慧等试验表明在离体条件下抑菌活性较低的甲醇提取物,用到活体植物上可诱导植物抗病性的提高。本研究也表明:青蒿和桉树植物提取物虽然在离体条件下对隐地疫霉的抑制活性较低,但用到活体植物上,对非洲菊疫病有较好的防治效果,可用于生物农药的开发。当然,试验所筛选的6种植物提取物对非洲菊疫病较好的防治效果,是否是由于其诱导了非洲菊植株对隐地疫霉抗性的提高,还是直接抑制了病原菌的生长,其原因及机理都有待进一步的研究。在筛选病害防治药剂时,最好结合室内和田间试验综合筛选,这样才可能筛选到真正有良好防效的杀菌剂。

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