BOYU官方 博鱼BOYU官方 博鱼生物碱（alkaloid）是一类天然存在的含氮碱性化合物，属于次级代谢产物。其种类多样，已知的生物碱约有超 10000 种，根据基本结构可分为 60 大类。

　　多项研究已证明，绝大多数生物碱具有明显的生理活性和药用价值，包括抗肿瘤、抗炎镇痛、抗菌抗病毒、护心血管作用、杀虫等功效。不过，当前植物源生物碱以植物提取为主，难以满足市场需求。

　　近日，来自江南大学的研究团队提出了一种高效生物合成生物碱的方法。在研究中，科研团队构建了一种四酶级联生物催化（four-enzyme biocatalytic cascade）模块，将秋水仙碱前体的合成途径简化为 4 步，同时避免了生物碱合成过程中植物来源 P450 的修饰，高效从现成的底物中合成了多种天然和非天然苯乙基异喹啉生物碱（PEIA）。

　　进一步讲，研究团队通过即插即用策略取代了速率受限的 O-甲基化（O-methylation），从而实现了高滴度秋水仙碱前体 (S)-autumnaline 的放大制备。

　　这项研究已发表在Nature Communications上。本文的通讯作者是江南大学生物工程学院教授饶义剑，他的研究方向是通过合成生物学、结构生物化学、合成化学和发酵工程等方法探索复杂天然产物（药物）的生物合成，以及重要生物转化过程与生物催化反应。

　　PEIA 结构复杂、生物合成途径长，以及表达植物来源的 P450 酶，这为基于微生物异源合成带来了诸多挑战。为了克服这些限制，研究团队通过酶发现（enzyme discovery）和酶工程化改造合理设计一种简洁的多酶级联模块，即四酶级联生物催化模块，促进底物在大肠杆菌中有效合成秋水仙碱前体 (S)-autumnaline 及其衍生物。

　　多酶级联反应是指将两种甚至更多的酶结合起来生产目标化合物。在这一过程中，能将连续的生物催化反应结合起来，从而实现从简单前体到高附加值化学品的转化。这种方法已发展为一种对环境友好且经济高效的药物合成工艺，正在彻底改变天然或非天然产品的制造方式。

　　首先，为了构建生物合成平台，研究人员分析了 (S)-autumnaline 的生物合成途径，并将这些途径分为两个模块，PEIA 模块和甲基转移（MT）模块，各模块分别对应两步酶反应。

　　其中，PEIA 由苯丙醛（PP 醛）和多巴胺衍生，PEIA 骨架由苯丙醛和多巴胺通过去甲氯嘌呤合成酶（NCS）合成。由于苯丙醛极易在微生物生产中转化为醇，因此，该团队引入羧酸还原酶（ carboxylic acid reductase，CAR）将苯丙酸原位转化为所需的醛。这两个模块与随后的 O-甲基转移酶和 N-甲基转移酶模块组成了四酶级联反应模块，也就将秋水仙碱前体超过 7 步的天然合成途径简化为了 4 步。值得一提的是，该过程避免了 P450 酶 CYP75A109 的修饰。

　　紧接着，研究人员通过工程化改造 CNMT 的结构提高其对 PEIA 的催化活性。通过一系列试验发现，基于组合诱变构建的变体CNMTN92A/F332A（也称为 CNMT*）的催化活性显著提高，提高了近 17.26 倍。

　　筛选出 CNMT* 之后，该团队通过体外一锅两步法评估了整个级联反应的可行性，PEIA 模块和 OMT 模块的催化步骤以顺序进行。反应结果表明，研究团队成功构建了一个更为简洁的四酶级联反应合成 (S)−1d。随后，研究团队在工程菌株 IAA 中分别构建了 PEIA 模块和 MT 模块再次验证了这一结论。研究人员在 MT 模块的测试中还发现，将 MT 模块进一步分为 OMT 模块和 NMT 模块即一锅三步法，可能会提高 (S)−1d 的产量。

　　然后，该团队评估了上述平台合成 (S)-autumnaline 和其他非天然衍生物的能力。他们测试了不同类型单取代基的 PP 酸（PP acids），产率在 70.95% 至 77.95% 范围内（1-10），具有双取代基底物的测试结果（11）也与这一结果类似。这些结果证明了所设计的生物催化级联模块是基于多种 PP 酸制备 PEIA 的通用高效平台。

　　研究人员表示，这些模块具有可扩展性。在 300mL 反应体系中可以得到 1.90mM 即 709.06mg/L 的 (S)-autumnaline 产物，产率达到 47.50%，这与 5mL 反应体系中的产率相似。该结果表明，研究团队设计的生物催化级联系统有潜力大规模制备 (S)-autumnaline，这有助于药物秋水仙碱的生物合成。

　　“这项研究不仅简化了生物合成秋水仙碱的流程，也为基于合成生物学方法构建人工生物催化级联模块制造多种生物碱提供了范例和平台。”